A procura por tecnologias ecologicamente corretas evidenciou o papel das enzimas na produção de biocombustíveis a partir da biomassa lignocelulósica. A produção eficaz de biocombustíveis levou à necessidade de pré-tratamentos que reduzem a recalcitrância da fibra de celulose, viabilizando o ataque enzimático e consequentemente a conversão da biomassa. O pré-tratamento com líquidos iônicos (LIs) tem se mostrado promissor por estes apresentarem propriedades peculiares e menor risco ambiental do que outros processos de pré-tratamento. A combinação entre LI e enzima despertou interesse biotecnológico e industrial, no entanto foram observadas desvantagens com alterações da estabilidade enzimática em função da temperatura, força iônica e composição do solvente, que provocam mudanças conformacionais e modificações nas forças intramoleculares que mantêm as estruturas das proteínas levando a desnaturação. A utilização de enzimas termoestáveis apresenta vantagens extras em processos biotecnológicos. Com base nisso, cinco enzimas foram escolhidas para o presente estudo por mostrarem tolerâncias díspares em crescentes concentrações de LI: as celulases de endoglucanases de Thermotoga maritima, Pyrococcus horikoshii, Trichoderma reesei, Fervidobacterium nodosum e Ganoderma lucidum, que são consideradas com melhor atividade na presença de LIs, incluindo o acetato de 1-etil-3-metilimidazólio, [EMIM] Ac, um potencial solvente para a biomassa também escolhido para este trabalho. Nosso estudo foi focado em simulações de Dinâmica Molecular (DM), representando qualitativamente o efeito de diferentes temperaturas e concentrações de LI em solução aquosa, onde investigamos os efeitos gerais das estruturas das celulases sobre os diversos fatores que alteram a sua estabilidade, a fim de compreender o quão resistentes são as celulases capazes de tolerar LI. Os resultados obtidos foram satisfatórios e qualitativamente representados por DM, as análises foram capazes de prever os efeitos da temperatura em 310K e 353K na resistência das celulases em água e sob as concentrações de 15% e 50% de LI. Simulações à temperatura elevada, de 500K, foram utilizadas para verificar os limites da resistência conformacional. Verificamos a estabilidade através de medidas de RMSD, RMSF, análises da estrutura secundária, área da superfície acessível ao solvente, ciclo de vida das ligações hidrogênio e das pontes salina. As celulases exibiram estabilidade satisfatória em função da temperatura e diferentes concentrações de solvente. No entanto, fazem-se necessários estudos mais aprofundados para entender os efeitos sobre as interações eletrostáticas proteína-líquido iônico e uma avaliação mais detalhada dos resíduos de aminoácidos específicos que possam influenciar na termoestabilidade.
ABSTRACT - The search for environmentally friendly technologies has demonstrated the role of enzymes in the production of biofuels from lignocellulosic biomass. The efficient production of biofuels has led to the need for pre-treatments that reduce the recalcitrance of the cellulose fiber, enabling the enzymatic attack and consequently the conversion of the biomass. The pretreatment with ionic liquids (LIs) has shown to be promising because they presented peculiar properties and lower environmental risk than other pretreatment processes. The combination of LI and enzyme has stimulated biotechnological and industrial interest, however, disadvantages have been observed with changes in enzymatic stability as a function of temperature, ionic strength and solvent composition, which cause conformational changes and changes in the intramolecular forces that maintain the protein structures leading the denaturation. The use of thermostable enzymes presents extra advantages in biotechnological processes. Based on this, five enzymes were chosen for the present study because they showed different tolerances in increasing LI concentrations: the endoglucanase cellulases of Thermotoga maritima, Pyrococcus horikoshii, Trichoderma reesei, Fervidobacterium nodosum and Ganoderma lucidum, which are considered to have better activity in the presence of LIs, including 1-ethyl3-methylimidazolium acetate, [EMIM] Ac, a potential solvent for biomass also chosen for this work. Our study was focused on computational simulations of Molecular Dynamics (DM), representing qualitatively the effect of different temperatures and concentrations of LI in aqueous solution, where we investigated the general effects of cellulase structures on the various factors that alter their stability, in order to understand how resistant are the cellulases capable of tolerating LI. The results were satisfactory and qualitatively represented by DM, the analyzes were able to predict the effects of temperature at 310K and 353K on cellulase resistance in water and at concentrations of 15% and 50% LI. Simulations at elevated temperature of 500K were used to check the limits of conformational resistance. We verified the stability through measurements of RMSD, RMSF, analyzes of the secondary structure, surface area accessible to the solvent, life cycle of the hydrogen bonds and the salt bridges. Cellulases exhibited satisfactory stability as a function of temperature and different solvent concentrations. However, further studies are needed to recognize the effects on electrostatic ion-protein interactions and a more detailed assessment of specific amino acid residues that may influence thermostability.
