A identificação rápida e precisa de patógenos é um componente essencial de vigilância biológica com benefícios para a saúde humana, assim como para as perspectivas em biodefesa pois estes podem representar uma ameaça à segurança nacional. As técnicas de detecção desses microorganismos de interesse devem ser mais sensíveis e específicas o possível e sem que haja interferência de contaminantes externos, para não haver erro no diagnóstico. A cultura de bactérias em meios específicos ou em tecidos ainda são considerados o padrão-ouro entres os testes clínicos e laboratoriais na identificação dos agentes patogênicos. No entanto, a detecção por ácidos nucleicos é baseada no sequenciamento do produto amplificado através de iniciadores que são pareados no DNA ou RNA da amostra contendo o microorganismo alvo. Esse tipo de técnica está entre as mais sensíveis e específicas, além de mais simples e rápidas. Nosso objetivo foi desenvolver ferramentas para detecção rápida e eficaz de patógenos que possam ser utilizados como arma biológica. Avaliamos o sequenciamento shotgun na plataforma Ion TorrentTM PGM® (Thermo Fisher Scientific® ) para a identificação precisa de um agente patogênico. Nossos resultados sugerem que essa não é a ferramenta mais adequada e robusta, devido à incerteza na distinção de espécies com potencial de arma biológica, principalmente quando os parâmetros de identificação são mais estringentes. Com isto, avaliamos o potencial de discriminação do gene 16S rRNA para as bactérias selecionadas, testando a sensibilidade da técnica de sequenciamento paralelo massivo. Portanto, para este experimentodesenhamos três pares de iniciadores baseados nas regiões conservadas do alinhamento das sequências consenso representativas das bactérias selecionadas (regiões [V1V2], [V4V5] e [V6V7V8], com aproximadamente 350 pb). Através do alinhamento do concatenado dessas três regiões-alvo dos iniciadores geramos uma árvore filogenética, a qual dividiu estes microorganismos em grupos monofiléticos, mostrando um potencial de distinção do gene a nível de gênero. Os três pares iniciadores desenhados para o 16S rRNA foram testados com sucesso nas amplificações de amostras de DNA das bactérias Vibrio cholerae, Escherichia coli, Salmonella enterica e Yersinia pestis. Além disso, o DNA de V.cholerae e E.coli foram sequenciados pelo método de Sanger e os resultados alinhados contra os bancos de dados GenBank e GreenGenes para validação das sequências. O teste de sensibilidade utilizando o gene 16S rRNA seguido do sequenciamento paralelo massivo na plataforma Ion TorrentTM PGM® (Thermo Fisher Scientific® ) foi determinado utilizando diferentes massas de DNA de E. coli, V. cholerae e S. enterica junto a amostras de DNA ambiental e humano. Em nossas condições, o límite mínimo de detecção da técnica para os patógenos alvo foi de 5 células.
ABSTRACT - The rapid and accurate identification of pathogens is an essential component of biological monitoring with benefits for human health as well as the prospects for biodefense as they may pose a threat to national security. Techniques for detecting these microorganisms of interest should be more sensitive and specific as possible, and without interference from external contaminants, so there is no error in the diagnosis. The bacterial culture in specific media or tissues are still considered the gold standard of clinical and laboratory tests to identify the pathogens. The detection by nucleic acids is based on base pairing reaction between the primers and the DNA or RNA from the sample containing the target microorganism. This type of technique is among the most sensitive and specific, as well as simpler and faster. Our goal was to develop tools for fast and effective detection of pathogens that can be used as a biological weapon.We evaluate the shotgun sequencing in the Ion TorrentTM PGM® (Thermo Fisher Scientific® ) platform for precise identification of the pathogen. Our results suggest that this is not the most appropriate and robust tool, due to uncertainty in species distinction with bioweapon potential, especially when the identification parameters are more stringent. Thus, we evaluated the potential for discrimination of the 16S rRNA gene for selected bacteria by testing the sensitivity of the massively parallel sequencing technique. For this experiment, we designed three primer pairs based on the conserved regions of the alignment of representative consensus sequencesof the selected bacteria (regions [V1V2], [V4V5] and [V6V7V8], with approximately 350 bp). By aligning the concatenated of these three target regions, we generate a phylogenetic tree, which divided these microorganisms in monophyletic groups, showing a potential for differenciation in gender level. The three primer pairs designed to the 16S rRNA have been successfully tested in the amplification of DNA samples of Vibrio cholerae, Escherichia coli, Salmonella enterica and Yersina pestis. Furthermore, the DNA of V. cholerae and E. coli were sequenced by the Sanger method and the results aligned against the databases GenBank and GreenGenes to confirmthe sequences. The sensitivity of the massively parallel sequencing test on the Ion TorrentTM PGM® (Thermo Fisher Scientific® ) platform using different masses DNA of E. coli, S. enterica and V. cholerae DNA with environmental and human DNA samples showed that the minimum detection limit of the technique to the target pathogens is 5.
