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Identificação e certificação de linhagens celulares de camundongos da espécie mus musculus através de genotipagem pela metodologia indel

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dc.contributor.author Gomes, Jorge Borges
dc.date.accessioned 2019-04-02T20:08:17Z
dc.date.available 2019-04-02T20:08:17Z
dc.date.issued 2016
dc.identifier https://sucupira.capes.gov.br/sucupira/public/consultas/coleta/trabalhoConclusao/viewTrabalhoConclusao.jsf?popup=true&id_trabalho=4947123 pt_BR
dc.identifier.uri http://hdl.handle.net/2050011876/1017
dc.description.abstract A espécie Mus musculus é um modelo experimental empregado em diversos setores da biotecnologia, possuindo alta similaridade biológica, fisiológica e genética com humanos. São seres largamente empregados para estudos de doenças, inclusive as multifatoriais, estudos de microbiota e desordens metabólicas, produção de proteínas recombinantes, suporte para células tronco embrionárias, pesquisa e desenvolvimento de medicamentos, validação de vacinas e formulação de produtos biotecnológicos. A identificação da linhagem celulares desta espécie é mandatório para a correta utilização deste modelo em pesquisas e desenvolvimento de produtos. A problemática mundial de identificação incorreta e contaminação das linhagens celulares de Mus musculus assombra toda a comunidade científica, pois o fato acarreta em resultados falsos e incomparáveis, tendo sido descoberto nos primórdios da sua implantação e estendendo-se até a atualidade. A metodologia recomendada para autenticação de linhagens celulares (seguindo os padrões utilizados para autenticidade celular humana) é o STR (short tandem repeats), mas a metodologia é de alto custo para o desenvolvimento e demanda muitos anos. Convém ressaltar que esta metodologia ainda não foi largamente implementada, para as linhagens celulares de camundongo, conforme ATCC (American Type Culture Collection). A identificação de espécies por metodologias de inserções e deleções (InDel) baseiam-se em regiões hipervariáveis que permitem a diferenciação através da determinação do comprimento da sequência (fragmentos com e sem inserções), sendo regiões menos susceptíveis a mutações recorrentes e reduzem a probabilidade de erros na classificação. Este trabalho tem como objetivo o desenvolvimento e a validação de um sistema de genotipagem de culturas celulares de camundongos da espécie Mus musculus. Abrange a utilização de 75 amostras referentes a linhagens celulares de Mus musculus, oriundas do Banco de Células do Rio de Janeiro (BCRJ). A extração do DNA ocorreu através do método Salting Out. Os pares de primers foram desenhados, testados in silico e in vitro quanto à compatibilidade e especificidade para aplicação na metodologia de PCR multiplex, compreendendo regiões com ocorrência de InDel nos cromossomos das espécie Mus musculus.Os testes in vitro compreenderam temperatura de anelamento e a compatibilidade entre os primers. Para avaliar este último parâmetro, os primers foram separados em dois mixes distintos, considerando maior grau de distinção por tamanho do fragmento gerado por cada marcador, para aplicação na metodologia de PCR multiplex. Diferentes linhagens celulares foram empregadas na análise, submetendo diferentes fatores para a otimização da reação do PCR multiplex, visando menor quantidade de bandas inespecíficas e maior determinação dos fragmentos esperados, conforme utilização de cada mix de pares de primers. Com a aplicação da metodologia de eletroforese em gel de poliacrilamida 20% em associação à desnaturação das amostras de diferentes linhagens celulares, abrangendo todos os pares de primers, tornou-se possível analisar e determinar a frequência dos marcadores na população estudada, evidenciando a invariabilidade (f = 0,0%) do InDel, conforme cada par de primers empregado para diferentes cromossomos, nas linhagens celulares analisadas, corroborando com resultados obtidos por eletroforese capilar. Torna-se imprescindível a criação de um sistema robusto e de alta especificidade para a certificação de linhagens celulares de Mus musculus, já que nota-se a permanência de propagação de contaminações e identificações erradas das mesmas, gerando resultados irreprodutíveis. A falta de acurácia e robustez dos bancos de dados é um fator preocupante, conduzindo muitos trabalhos por estratégias metodológicas equivocadas, comprometendo a capacidade preditiva do arcabouço teórico. Neste trabalho, observou-se a falta de variabilidade na população estudada para todos os marcadores elencados, ou seja, os marcadores são incapazes de individualizar uma amostra dentro de uma população, apenas dentro de uma comunidade (identificação e espécie). pt_BR
dc.description.abstract ABSTRACT - The Mus musculus species is an experimental model used in various sectors of biotechnology, having high biological, physiological and geneticsimilarity with humans. They are being largely used for studies of diseases, including multifactorial microbial studies and metabolic disorders, production of recombinant proteins, support for embryonic stem cell, research and drug development, validation of vaccine and formulation of biotechnological products. The identification of thiscell line of this type is mandatory for proper use of this model in research and product development. The global problem of misidentification and contamination of Mus musculuscell lines haunts the entire scientific community, because the fact entails on false and unparalleled results, having been discovered in the beginning of its implementation and extending to the present. The recommended methodology for cell lines authentication of cell lines (following the standards used for human cell authenticity) is the STR analysis (short tandem repeats), but the method is highly cost for and demand many yearsthe development. It is worth mentioning that this method has not yet been widely implemented, for mouse cell lines as ATCC (American Type Culture Collection). Species identification by insertions and deletions (InDel) methods of based on hypervariable regions that allow differentiation by determining the sequence length (fragments with and without inserts), are less susceptible regions to recurrent mutations and reduce the likelihood of errors in classification. The research aims to the development and validation of a genotyping system of cell cultures of Mus musculus species mouse. Covers the use of 75 samples related to cell lines Mus musculus, from the Bank of Cells of Rio de Janeiro (BCRJ). The DNA extraction occurred by Salting Out method. Molecular markers have been designed and tested in silico and in vitro for compatibility and specificity for use in multiplex PCR methodology, comprising areas with occurrence of InDel in the chromosomes of Mus musculus species. Thein vitro tests performedannealing temperature and the compatibility between the primers.To evaluate this last parameter, the primers were separated in two distinct mixes, considering higher degree of distinction by fragment size generated by each marker, for application to the multiplex PCR methodology. Different cell lines were used in the analysis, submitingdifferent factors for optimizing the multiplex PCR reaction aiming least amount of nonspecific bands and betterdetermination of the expected fragments, as each molecular markers mixes used molecular markers. With the application of electrophoresis method in 20% polyacrylamide gel in association with denaturation of different cell lines, samples covering all molecular markers,it became possible to analyze and determine the frequency of markers in the studied population, indicating the invariance (f = 0.0%) of InDel as each molecular marker used for different chromosomes in the analyzed cell lines, confirming results obtained by capillary electrophoresis.It becomes essential to create a robust system and high specif for certification of cell lines Mus musculus, as we note the continuing spread of contamination and misidentification of the same, generating irreproducible results. The lack of accuracy and robustness of the database is a concern, leading many jobs for the wrong methodological strategies, compromising the predictive ability of the theoretical framework. In this study, there was a lack of variability in the studied population for all markers listed, namely, the markers are unable to distinguish a sample within a population, only within a community (identification and species). pt_BR
dc.format.extent 114 f. pt_BR
dc.language.iso Português (Brasil) pt_BR
dc.subject.classification Metrologia científica e aplicada pt_BR
dc.subject.classification Biotecnologia pt_BR
dc.subject.classification Metrologia pt_BR
dc.title Identificação e certificação de linhagens celulares de camundongos da espécie mus musculus através de genotipagem pela metodologia indel pt_BR
dc.title.alternative Certification and identification of mouse cell line of the specie mus musculus by indel genotyping pt_BR
dc.type Dissertação pt_BR
dc.rights.license É permitida a reprodução deste texto e os dados nele contidos, desde que citada a fonte. Reprodução para fins comerciais são proibidas. pt_BR
bom.learningResourceType Dissertação pt_BR
dc.mediator Instituto Nacional de Metrologia Qualidade e Tecnologia (INMETRO) pt_BR
dc.rights.type Domínio Público pt_BR
dc.subject.decs Metrologia pt_BR
dc.subject.decs Metrologia científica e aplicada pt_BR
dc.subject.decs Medição pt_BR
dc.subject.keyword Biotecnologia pt_BR
dc.subject.keyword Genotipagem pt_BR
dc.subject.keyword Genotyping pt_BR
dc.subject.keyword Mus musculus pt_BR
dc.subject.keyword InDel pt_BR
dc.subject.keyword In silico pt_BR
dc.subject.keyword In vitro pt_BR
dc.subject.keyword Reação em cadeia da polimerase multiplexada pt_BR
dc.subject.keyword Multiplex polymerase chain reaction pt_BR
dc.location.country Brasil pt_BR
dc.contributor.advisor Moura Neto, Rodrigo Soares de
dc.contributor.advisor Gomes, Bruno Cosme da Silva
dc.description.annotation Dissertação de Mestrado apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia do Instituto Nacional de Metrologia, Qualidade e Tecnologia, como parte dos requisitos para obtenção do título de Mestre em Ciências. pt_BR


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