Durante muito tempo, o cultivo bidimensional (2D) foi utilizado em vários experimentos e contribuiu muito para compreensão da biologia das células e seu comportamento. No entanto, é sabido que a arquitetura natural das células se arranja de forma tridimensional (3D), havendo forte interação célula-célula. Tal interação é bem menos intensa em células cultivadas em monocamada. Há, portanto, uma tendência de transição do uso de cultivo 2D para o 3D, pois o cultivo 3D poderia mimetizar a estrutura celular e tecidual encontrada in vivo. Há muito tempo tem-se observado que testes de drogas realizados em cultivos 2D não respondem com a mesma eficiência em relação ao observado in vivo, levando a indústria farmacêutica a seguir a mesma tendência. Além disso, o cultivo 3D possui vantagens como automação, baixos custos, reprodução em grande escala e aplicabilidade, que são interessantes para o ramo de desenvolvimento de novas drogas. No entanto, a problemática encontrada é a baixa eficácia de protocolos em cultivo 3D, principalmente que possa atender a protocolos de testes de drogas. Atendendo a essa necessidade, o presente trabalho tem como objetivo padronizar um cultivo de células humanas progenitoras de cartilagem de septo nasal em sistema de cultivo3Descalonável de formação de esferoides, como um novo processo para teste de drogas e desenvolvimento de novas terapias. As células progenitoras de cartilagem foram cultivadas e expandidas em monocamadas. Após dissociação, foram plaqueadas em hidrogel de agarosemicromoldada para produção de esferoides. Depois da formação dos esferoides e de 3 semanas de cultivo, foram realizadas análises morfofuncionais. Foi observada alta viabilidade celular nos esferóides, avaliada por citometria de fluxo e microscopia de fluorescência. Além disso, células cultivadas em 3D apresentaram um tamanho do que as cultivadas em2D. Os esferoides apresentaram uma constituição de moléculas fundamentais para o processo condrogênico como (colágeno tipo I, II e VI), bem como de N-caderina eglicosaminoglicanossulfatados (agrecana e sulfato de condroitina), detectados por imuno-histoquímica. Foi avaliada a secreção de membros da família do fator decrescimento de transformação (TGF, do inglês transforminggrowth fator)- importantespara a condrogênese - no sobrenadante de cultivo celular nossistemas2D e 3D. A quantidade de TGF-β1 e -β2 em monocamada foi estatisticamente menor em relação ao cultivo 3D (p<0,0001) dois dias após a formação dos esferoides. No entanto, após 3 semanas de cultivo 3D, os níveis de TGF-β1 e -β2 diminuem de maneira estatisticamente significativa (p<0,0001). Não foram observados níveis detectáveis de TGF-β3.A análise do perfil genético mostrou uma alta expressão de genes ligados à via condrogênica, como o trio Sox-5, -6 e -9, quando as células progenitoras de cartilagem são cultivadas em 3D, sendo significativamente maior do que quando cultivadas em 2D (p<0,05).Estes resultados sugerem que células progenitoras de cartilagem possuem um loop autócrino que influenciam a diferenciação condrogênica principalmente quando cultivadas em 3D.Além disso, o modelo de produção utilizado é passível de robotização, o que permite a fabricação de esferoides em grande escala, atendendo a um requisito para testes de drogas.
ABSTRACT - For a long time, the two-dimensional (2D) cell culture system was used in many experiments and contributed to the current knowledge ofthe cell biology. However, It is well known that cell architecture in its natural environment is in a three-dimensional (3D) manner, with strong cell-cell interactions. Such interactions are far less strong when cells are cultured in monolayers. Thus, there is a tendency from using 2D to use 3D cell culture systems. Drug testing in 2D cell culture do not respond with the same efficiency as 3D. Therefore, the pharmaceutical industry tends to follow the same tendency. In addition, 3D cell culture systemshave great advantages such as automation, low cost, large-scale production and applicability, which areinteresting for drug discovery. However, the low efficiency in 3D culture protocols represents a limitation for drug testing demands. The present study aims to standardize a scalable three-dimensional cell culture system of human progenitor cells from nasoseptal cartilage as a new process for drug testing and development of new therapies. Cartilage progenitor cells were grown as monolayers before plated onto micromolde agarose hidrogel to form spheroids. After the formation of spheroids and cultivation for 3 weeks, morphological and functional analyses were carried out. High cell viability in spheroids was observed, using bothflow cytometry and fluorescence microscopy. Moreover, cells cultured in 3D showed a smaller size than those cultivated in 2D. Spheroids showed to be composed of molecules fundamental for chondrogenesisas collagen type I, II and VI. In addition, the adhesion molecule N-cadherin and sulfated glycosaminoglycans (aggrecan and chondroitin sulfate) were also present. Thesecretion ofTGF family members - an important growth factor family for chondrogenesis - were analyzed in cell culture supernatants in both 2D and 3D systems. TGF-β1 and -β2 secreted by cell in monolayer was lower than in the 3D culture 2 days after the formation of spheroids. However, after 3 weeks of culture, levels the TGF-β1 and–β2 decreased in a significant manner (p<0,0001). There were no detectable levels of TGF-β3. Genetic analysis showed a high expression of genes associated to chondrogenesis, like Sox-5, -6and -9, inprogenitor cells grown in 3D, which was significantly higher than in 2D (p<0,05). These results suggest that cartilage progenitor cells have an autocrine loop that affect the chondrogenic differentiation especially when grown in 3D.In addition, the method of spheroids fabrication used in this project is liable to automation, allowinga large-scale production, which is a requirement for drug testing.
